В 1732 году Анна Иоанновна объявила, что трон наследует потомок по мужской линии её племянницы Елизаветы-Екатерины-Христины, дочери Екатерины Иоанновны, герцогини мекленбургской. Екатерина, родная сестра Анны Иоанновны, была выдана Петром I замуж за мекленбургского герцога Карла-Леопольда, но в 1719 году с годовалой дочерью удалилась от мужа в Россию. Анна Иоанновна следила за племянницей, получившей после крещения в православие имя Анны Леопольдовны, как за своей собственной дочерью, особенно после смерти в 1733 Екатерины Иоанновны.

В июле 1739 году Анну Леопольдовну выдали замуж за герцога брауншвейгского Антона-Ульриха, и в августе 1740 у пары родился сын Иоанн Антонович.

5 (16) октября 1740 года Анна Иоанновна села обедать с Бироном. Вдруг ей стало дурно, она упала без чувств. Болезнь признали опасной. Среди высших сановников начались совещания. Вопрос о престолонаследии был давно решён, своим преемником императрица назвала двухмесячного ребёнка, Иоанна Антоновича. Оставалось решить, кто будет регентом до его совершеннолетия, и Бирон смог собрать голоса в свою пользу.

16 (27) октября с больной императрицей сделался припадок, предвещавший скорую кончину. Анна Иоанновна приказала позвать Остермана и Бирона. В их присутствии она подписала обе бумаги — о наследстве после неё Иоанна Антоновича и о регентстве Бирона.

В 9 часов вечера 17 (28) октября 1740 года Анна Иоанновна скончалась на 48-м году жизни. Врачи причиной смерти объявили подагру в соединении с каменной болезнью. При вскрытии обнаружили в почках камень величиной с мизинец, что и явилось основной причиной смерти. Похоронили её в Петропавловском соборе в Петербурге.